Подход CRISPR «Minigene» предотвращает развитие генетических заболеваний печени у мышей

Подход CRISPR «Minigene» предотвращает развитие генетических заболеваний печени у мышей

Новая методика редактирования генов CRISPR предотвратила генетическое заболевание печени, которое, как известно, вызвано сотнями различных мутаций, и улучшила клинические симптомы у мышей, сообщили исследователи Penn Medicine в новом исследовании, подтверждающем концепцию, опубликованном в Интернете в Science Advances . Полученные данные свидетельствуют о многообещающем инструменте CRISPR, который потенциально может лечить пациентов с редким метаболическим нарушением цикла мочевины, вызванным дефицитом фермента орнитинтранскарбамилазы (OTC), а также другими наследственными заболеваниями, вызванными различными мутациями одного и того же гена.

Подход CRISPR основан на предыдущем подходе, разработанном в Penn Medicine, который ограничивался исправлением только одной мутации – он принес пользу новорожденным мышам, но не взрослым. На этот раз метод, в котором используется новый двойной аденоассоциированный вирус (AAV) для доставки его компонентов, встраивает «миниген» в геном, чтобы обеспечить устойчивую экспрессию ОТС в клетках печени, что известно как Подход «вырезать» и «вставить». Никакие мутации не исправляются, а в ячейки добавляется новый набор инструкций. В результате исследователи наблюдали клиническую пользу у новорожденных мышей, которая сохранялась во взрослом возрасте.

«Как и большинство генетических заболеваний, которые приводят к летальному исходу у новорожденных, очень важно раннее лечение, эффективное в долгосрочной перспективе», – сказал Джеймс Уилсон, доктор медицинских наук , профессор медицины и директор Программы генной терапии и Центра сиротских болезней. в Пенсильвании. «Здесь мы продвинули подход CRISPR, чтобы не только поддерживать экспрессию ОТС в клетках, но и расширить возможности инструмента. Наша цель – в конечном итоге применить этот подход к редактированию генов у животных для лечения пациентов с безрецептурными расстройствами и другими генетическими заболеваниями, вызванными мутациями, разбросанными по всему гену, а не единственной преобладающей мутацией ».

Обнаруженное почти у одного из 40 000 родов, внебиржевое заболевание может быть вызвано более чем 300 различными мутациями в гене ОТС. Поскольку эти мутации происходят на Х-хромосоме, они обычно встречаются у мужчин, а женщины являются носителями. Цикл мочевины представляет собой серию из шести ферментов печени, которые помогают избавить организм от аммиака. Когда один из этих ферментов отсутствует или недостаточен, аммиак накапливается в крови и попадает в мозг, что может вызвать повреждение мозга и даже смерть. Для лечения болезни пациенты принимают лекарства, стимулирующие альтернативные пути выведения азота , или, в тяжелых случаях, трансплантацию печени. Однако смертность у этих пациентов все еще высока, поэтому существует потребность в более новых и более эффективных методах лечения.

Чтобы разработать широко применимый инструмент для редактирования генома, команда создала новый двойной вектор AAV, содержащий управляемый РНК бактериальный белок, известный как Cas9, – быстрый и надежный метод поиска генов в клетках и управления ими. Этот вектор, разработанный Пенном, известен как AAV8, специфически имеет сродство к клеткам печени. Второй AAV содержал полностью функционирующий «миниген», экспрессирующий человеческий OTC с оптимизированными кодонами – донорскую ДНК, управляемую специфическим для печени промотором, чтобы гарантировать, что он экспрессируется только в клетках печени при введении в кровь.

Первым шагом является создание разрыва в ДНК с помощью Cas9 в целевом сайте вдоль гена («разрез»), что создает основу для добавления минигена в так называемую гомологически направленную репарацию, или HDR ( “вставить”).

«В отличие от других подходов CRISPR, которые удаляют или модифицируют часть нормального гена, этот метод интегрирует новую часть», – сказала первый автор Лили Ван, доктор философии , доцент медицины. «Мы не пытаемся исправить мутации, которые мешают клеткам печени производить ОТЦ, мы добавляем этот новый миниген, чтобы клетки могли».

У мышей, обработанных вектором-мишенью, через три и восемь недель в печени было обнаружено 25 и 35 процентов клеток, экспрессирующих ОТС, соответственно, что в четыре и три раза больше, чем у мышей, получавших нецелевой вектор. В оба момента времени (три и восемь недель) большинство ОТС-положительных клеток печени располагались в кластерах, разбросанных по всем участкам печени у целевых мышей.

Ссылка на основную публикацию